從2016年FDA批準(zhǔn)首個(gè)基于EGFR基因突變的液體活檢產(chǎn)品，到今年8月bTMB被證實(shí)可以預(yù)測(cè)免疫治療的效果，液體活檢已在腫瘤治療領(lǐng)域大放異彩。

不幸的是，血液中的腫瘤循環(huán)DNA分子含量通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血液中非癌癥相關(guān)DNA的片段，這使得檢測(cè)它們非常困難，特別是在癌癥的早期階段。

今天，英國(guó)劍橋大學(xué)科學(xué)家Nitzan Rosenfeld帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)，終于為液體活檢打開了封印。他們發(fā)現(xiàn)了血液中循環(huán)腫瘤DNA和非腫瘤DNA片段的長(zhǎng)度分布特征。找到了一種更靈敏的血液中腫瘤DNA檢測(cè)方法。

研究者們?cè)隗w外富集血漿中特定片段長(zhǎng)度的游離DNA（cfDNA），然后測(cè)序，發(fā)現(xiàn)用測(cè)序結(jié)果區(qū)分腫瘤血液樣本和健康血液樣本時(shí)，曲線下面積超過(guò)0.99，而未富集的普通cfDNA檢測(cè)只有不到0.8。此外，這種富集的方法可以使液體活檢在更早期就能檢測(cè)到癌癥。這項(xiàng)研究發(fā)表在最新一期的著名學(xué)術(shù)期刊Science Translational Medicine 上[1]。

前排中間為Nitzan Rosenfeld博士

血漿中存在著很多游離的DNA（cfDNA），包括腫瘤來(lái)源的（ctDNA），以及非腫瘤來(lái)源的。非腫瘤來(lái)源的DNA占了cfDNA的絕大部分，使得ctDNA的豐度很低[2]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)ctDNA在cfDNA中的豐度在10%或以上時(shí)，才能得到準(zhǔn)確的腫瘤信息[3]。但是，除了某些晚期的腫瘤會(huì)釋放大量ctDNA外，大多數(shù)腫瘤患者的ctDNA的豐度達(dá)不到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

目前，主要是通過(guò)加大測(cè)序深度來(lái)提高ctDNA檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確率，但是加大測(cè)序深度可能會(huì)帶來(lái)假陽(yáng)性的結(jié)果，因?yàn)榉悄[瘤來(lái)源的DNA中也可能帶有各種腫瘤相關(guān)的突變[5]。這些問(wèn)題一直限制著液體活檢的應(yīng)用。

不過(guò)，科學(xué)家的另一個(gè)發(fā)現(xiàn)卻可能解決這個(gè)問(wèn)題。之前有研究表明，不同細(xì)胞釋放到血液中的cfDNA的長(zhǎng)度會(huì)有所不同，例如，很多cfDNA的長(zhǎng)度都是167bp（與一個(gè)核小體的DNA長(zhǎng)度類似），這可能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中半胱天冬酶依賴的DNA裂解相關(guān)[6]。

嬰兒的cfDNA就明顯比母親的cfDNA片段短，這個(gè)特點(diǎn)被運(yùn)用與產(chǎn)前診斷[7]。這些研究說(shuō)明不同細(xì)胞來(lái)源的cfDNA在長(zhǎng)度上會(huì)呈現(xiàn)獨(dú)特的模式，可能可以作為區(qū)分cfDNA來(lái)源的信號(hào)。

這種cfDNA片段長(zhǎng)度的差異很可能就存在于腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞之中。這是一個(gè)絕妙的假設(shè)，如果這個(gè)假設(shè)成立，就可能解決腫瘤液體活檢面臨的困境。

不過(guò)，之前少數(shù)幾個(gè)在此方面的研究卻得出了相互沖突的結(jié)果，使得這方面的研究裹足不前。他們的問(wèn)題主要在于不了解造成這種生物學(xué)差異的原因[8]。也即，不知道腫瘤細(xì)胞的DNA長(zhǎng)度為什么會(huì)不同，使DNA片段的長(zhǎng)度特征信號(hào)無(wú)法準(zhǔn)確地代替腫瘤cfDNA。

Nitzan Rosenfeld博士接過(guò)了這個(gè)研究的大旗。他們猜測(cè)之前研究者失敗的原因，可能是得到的ctDNA片段的長(zhǎng)度特征信號(hào)不夠靈敏。

于是，Rosenfeld博士帶領(lǐng)的研究者們?cè)O(shè)計(jì)新的方案進(jìn)行了研究。他們從200個(gè)癌癥病人中收集了344份血漿樣本（包括18種不同類型的癌癥），然后取了65個(gè)健康人的血漿樣本作為對(duì)照。提取這些血漿樣本中的cfDNA后，分析發(fā)現(xiàn)健康人與癌癥患者的cfDNA在90 - 150 bp、180 - 220 bp和250 - 320 bp之間的分布都有所不同。

當(dāng)他們將這些cfDNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)了令人驚訝的結(jié)果，帶有癌癥突變的ctDNA片段普遍比核小體DNA片段（167bp）短20-40bp，在90-150bp區(qū)間富集，還有些在250-320bp之間富集（這可能是腫瘤細(xì)胞的雙核小體片段）。

帶腫瘤突變的片段在一個(gè)區(qū)間富集

以上結(jié)果可能預(yù)示著ctDNA在90-150bp區(qū)間的豐度可能會(huì)很高。研究者們?cè)谝环N硅芯片上將cfDNA在按片段長(zhǎng)度進(jìn)行分離，通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)在90-150bp區(qū)間中，ctDNA的豐度明顯提高。這說(shuō)明可以通過(guò)富集短片段的方法提高ctDNA的豐度，進(jìn)而能提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

于是，研究者們先用這種片段選擇性測(cè)序的方法檢測(cè)癌癥病人的腫瘤進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)比CT成像提前了60天檢測(cè)了腫瘤進(jìn)展，而比未經(jīng)過(guò)片段選擇性的液體活檢提前了89天。片段選擇性測(cè)序顯示了無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)！

新方法的優(yōu)勢(shì)還不止于此，研究人員取了一個(gè)隊(duì)列研究中48份腫瘤患者的血漿樣品，分別通過(guò)cfDNA片段選擇性測(cè)序和普通cfDNA測(cè)序，與已知結(jié)果相比，兩者的準(zhǔn)確率分別是82%和50%。片段選擇性測(cè)序?qū)?zhǔn)確率的提升幅度異常明顯。

但是，科學(xué)家對(duì)這個(gè)結(jié)果還不是很滿意，覺(jué)得它還有提升的空間。因?yàn)槠渌L(zhǎng)度的片段上也存在腫瘤突變，而只取90-150bp的片段會(huì)丟失一些信息。這種粗獷劃分顯然不能代表現(xiàn)代科學(xué)的水平。

接著，研究者們將各個(gè)長(zhǎng)度區(qū)間的片段，包括P（20 to 150），P（100 to 150），P（160 to 180）， P（180 to 220），以及 P（250 to 320），都進(jìn)行了分析，結(jié)合已知的突變位點(diǎn)，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法去尋找更加精細(xì)的規(guī)律，得到了一個(gè)人工智能模型。用這個(gè)模型在區(qū)分腫瘤血液樣本和健康血液樣本時(shí)，曲線下面積達(dá)到0.994，相當(dāng)令人震撼！

片段特異性測(cè)序顯示了完美的準(zhǔn)確率

當(dāng)然，作者表示他們的方法還有一定局限性，那就是他們?cè)隗w外對(duì)不同片段長(zhǎng)度的DNA進(jìn)行分離的方法，會(huì)造成一定偏差。可能不能準(zhǔn)確反應(yīng)小于100bp和大于300bp長(zhǎng)度的ctDNA。

盡管如此，從已達(dá)到的效果來(lái)看，這個(gè)通過(guò)片段特異富集進(jìn)行液體活檢的方法，可以更早更靈敏地檢測(cè)腫瘤，這對(duì)于腫瘤的治療有重要意義！

本文第一作者M(jìn)oulier說(shuō)道，理論上這項(xiàng)新技術(shù)可以用于檢測(cè)所有類型的腫瘤。并且，這種技術(shù)對(duì)很多實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)都很簡(jiǎn)單，這意味著在不久的將來(lái)，它就能對(duì)公眾開放[9]。(生物谷世聯(lián)博研Bioexcellence）

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