基因特異性的失活策略是神經生物學研究的重要方法，對于闡釋基因在神經系統中的基本生物學功能不可或缺。隨著神經科學的高速發展，單一基因的敲除/敲低逐漸不足以滿足研究者的要求。尤其是對于復雜的多蛋白復合物和多基因神經疾病，多重基因元素失活的條件性組合搭配正日益成為主流需求。然而，逐一構建不同基因的敲除/敲入動物模型再進行雜交，一直受限于低下的制備效率、冗長的制作周期和昂貴的成本費用，成為了實際研究中的主要瓶頸之一。因此，快捷簡單地操作大腦中的基因表達的方法亟需建立。

近期，基于dCAS9的多基因激活系統已紛紛有報道出現。一個多月前，Salk生物研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte課題組就在Cell發表相關工作，并且提出了“targeted epigenetic therapies”這個概念，并在幾個小鼠疾病模型中得到驗證【1】，詳見此前BioArt的報道：Cell丨精確制導，安全提升，基于靶向表觀遺傳治療的新一代CRISPR/Cas9技術；前不久中科院神經科學研究所楊輝研究組與上海科技大學黃鵬羽實驗室合作在Nature Neuroscience雜志上也發表了相關研究論文，該研究建立了一種高效的基于CRISPR/dCas9的體內激活平臺，并且在小鼠腦中實現了包括基因和長鏈非編碼RNA在內的多個基因元件的同時激活【2】，詳見BioArt此前的報道：楊輝、黃鵬羽合作組利用dCas9轉基因小鼠在腦內實現多基因同時激活。盡管目前已有不少利用dCAS9操作多基因激活的報道出現，但是關于利用該技術實現多基因敲低的報道相對比較少，進展也慢一些。

2月5日，Nature Neuroscience以Technical Reports的形式在線發表了由清華大學生命科學聯合中心姚駿課題組和中科院北京基因組所米雙利課題組合作完成的題為“CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain”的研究論文，報道了他們建立的在動物腦內進行基于CRISPR interference (CRISPRi)的多重基因條件性敲低平臺，為在體研究復雜蛋白復合物的功能和多基因神經疾病的發病機理提供了重要的工具。

CRISPR/Cas9基因編輯工具已被廣泛用于建立轉基因細胞株和動物模型。然而，該技術目前在神經科學中的應用還很局限。一方面，神經元的不可分裂的特性決定了無法以建立細胞系的方式來研究特定基因在神經元中的功能。另一方面，CRISPR/Cas9切割后產生的非同源末端連接修復常常導致非特異性的刪除、插入或其它突變，導致在單細胞水平產生多種表型變化，例如雜合型、純合失活型和野生型等，將可能對后續實驗產生不必要但卻可能是非常嚴重的干擾。

在這項研究中，研究人員利用病毒傳遞策略，針對神經元構建了優化的基于dCas9融合KRAB的CRISPRi系統（dCas9-KRAB，KRAB是著名的轉錄抑制因子）【3，4】，達到在小鼠腦內進行高效且靶向特異性的抑制功能基因表達的目的。該系統不但在單細胞水平獲得均一的表型，而且在基因沉默水平上顯著優于傳統的RNAi技術。利用sgRNA相隔錯配的“釣魚”策略，作者進一步證明基于dCas9的CRISPRi技術在神經元中具有精確的靶向特異性，幾乎不會產生脫靶效應。因而，針對神經元特異的CRISPRi技術可用于快速地構建腦內基因特異性敲低的動物模型，能夠大大縮短了研究時間和花費。

作者進一步拓展該技術在動物腦內的應用，利用神經元亞群特異性的啟動子條件性控制功能基因Syt1在海馬齒狀回興奮性和抑制性神經元中的獨立失活，以達到雙向調節局部神經網絡的興奮/抑制平衡的目的。分子生物學和電生理學實驗證明，條件性CRISPRi能精確控制Syt1基因在特定類型神經元中喪失功能而不影響Syt1在其它類型細胞中的表達。進一步的動物行為學測試表明，上調或下調齒狀回神經網絡的興奮/抑制平衡，使得小鼠學習記憶能力出現相應的雙向變化；然而，無論是平衡朝哪個方向移動，小鼠均表現出抑郁和焦慮行為。

這些基于條件性CRISPRi的實驗結果表明，海馬區對于動物學習記憶和精神活動的調節具有完全不同的機制。最后，作者建立了靶向Syt1及其互作蛋白網絡的基因Syb2，Stx1a/b和SNAP25a的五重基因CRISPRi。這一測試采用兩種不同的策略，分別是：1）多種聚合酶III型啟動子獨立驅動的sgRNA表達框和dCas9-KRAB共表達的一體化載體系統；2）串聯表達的同種聚合酶III型啟動子驅動sgRNA表達框與dCas9-KRAB獨立表達的雙載體系統。實驗證明，這兩套系統都能夠在小鼠腦內實現靈活多變的多基因不同組合的高效失活。因此，針對神經元的CRISPRi能夠靈活地實現小鼠腦中復雜基因網絡的條件性調節。

該研究的一系列實驗證明，基于病毒傳遞策略的CRISPRi工具，能夠在動物出生后的各個階段，包括在生理及病理狀態下實現在體操作，建立神經元和動物模型，從分子到細胞，從環路到行為，解析多重基因和復雜表型之間的關聯，探索復雜腦疾病的致病機制，并在此基礎上尋求新型有效的治療策略。因而，該研究工作為神經生物學研究提供了靈活而多樣的基因操作工具。

據悉，清華大學生命學院及生命中心PI姚駿研究員和中科院北京基因組所米雙利研究員為本文共同通訊作者，生命學院博士后鄭毅和沈偉為本文共同第一作者，中科院北京基因組所博士生張健、清華生命學院博士生劉要南、喻霞、盧思瑤和陳運等為本項研究工作做出重要貢獻。姚駿研究員為青年**獲得者，主要從事神經疾病和突觸信號傳導研究，近年來作為第一作者或通訊作者在Nature、Cell、Nature Neuroscience等國際一流期刊發表論文多篇。(世聯博研(Bioexcellence)世聯博研Bioexcellence）