CRISPR/Cas系統是從原核生物中發現的一種防御外源性遺傳物質入侵的自身免疫機制，主要分為三種類型：Type I、Type II和Type III。而常用的CRISPR/Cas9系統是由II型改造而來，具有核酸酶活性，并能夠通過向導RNA的作用靶向性結合生物基因組任何區域的目的基因，進而實現對目標基因的編輯。該系統最早被開發并最成熟的是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)，它具有較高的切割活性和保真性，是目前研究最深入的Cas酶之一。它識別的序列需要臨近3’端有一段序列，即PAM（protospacer adjacent motif）。經典的PAM是NGG，而非經典PAM序列是NAG（N指 A/T/C/G）【1，2】。

在哺乳動物細胞中，SpCas9對靶位點在PAM為NGG時編輯效率是NAG的15倍；而中國水稻研究所王克劍教授團隊對水稻基因組進行編輯時，則發現SpCas9在NAG位點的編輯效率約為NGG位點的76.44%，且保真性更高【3】。筆者利用人類細胞對應的報告系統對16個不同的PAM序列進行篩選后發現，SpCas9在部分位點對PAM為NGA的有效切割效率分別是NGG、NAG位點的0.5倍和2倍【4】。這項研究顯示野生型SpCas9在人類細胞中可以利用其他非經典的PAM，但是效率并不高，也提示挖掘適用范圍更廣的SpCas9是有可能的。

古詩云：“長江后浪推前浪，浮事新人換舊人。”同樣，在CRISPR的“舞臺”上更是新秀迭出。

2018年1月29日Nature Biotechnology 在線發表的文章A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast介紹了一種篩選SpCas9突變體的方法——酵母報告菌株篩選法。利用易錯突變在SpCas9的REC3結構域處制造隨機突變并構建突變體庫，然后經酵母報告菌株（yACMO-off1–4）進行篩選并鑒別出較優突變體（圖1）。研究者將篩選出的四個較優突變體進行組合突變，產生了最優突變體——evoCas9（evolved Cas9）。該突變體除了具有良好的靶向性和切割活性，它最突出的特點是超高的保真度，比之于野生型SpCas9提高了79倍【5】。鑒于此，evoCas9在基因編輯為基礎的基因治療方面將具有重要意義。

無獨有偶，2018年2月28日Nature在線發表了Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity。在該項研究中，為了更快速獲得理想的SpCas9突變體，David Liu團隊使用了獨門秘籍——PACE（phage-assisted continuous evolution）（圖2，圖3）。其實早在2011年，Nature 就刊登了David Liu 的另一篇文章A System for the continuous directed evolution of biomolecules，介紹了PACE定向進化技術【6】。該方法與以往在Cas酶編碼基因序列中人為地制造突變，再利用原核/真核細胞進行功能篩選不同。PACE所使用的大腸桿菌含有誘導突變發生的質粒MP（mutagenesis）和激活后能表達PⅢ（噬菌體存活的必需基因）的質粒AP（accessory plasmid）。研究者們把需要突變的Cas酶蛋白編碼基因序列放進噬菌體基因組，轉染宿主大腸桿菌。PACE利用噬菌體繁殖周期短的特點，對Cas酶進行大批量、持續性的突變并定向篩選噬菌體。這項PACE技術通過把生物分子的實驗室進化和噬菌體的生命周期結合在一起，一周內就能夠實現成百上千次的傳代變異，在誘變效率上比傳統方法提高了100倍。

在PACE技術的助攻下，突變體CRISPR/xCas9 3.7的出現，如雨后春雷，給基因編輯的應用發展帶來了歷史性的變革。比之于SpCas9，由SpCas9進化而來的xCas9 3.7有著更多的潛力。第一，xCas9 3.7具有更靈活的PAM選擇性，能識別更大范圍的PAM序列，包括NGG、NG、GAA和GAT；第二，它具有更優的靶向轉錄激活性和更強的切割基因的能力；第三，新構建單堿基編輯器xCas9(3.7)–BE3能夠對致病性突變位點進行C？G→T？A和A？T→G？C的堿基替換，其效率分別高達73%和71%，明顯優于SpCas9–BE3；第四，xCas9 3.7表現出極強的特異性，在PAM為NGG的EMX1基因靶位點處甚至沒有脫靶。但令人困惑不解的是，xCas9 3.7的PAM序列識別靈活性、酶活性和保真性同時得到優化的現象突破了以往三者之間存在某種制衡的概念。目前這項工作仍然留下了不少需要回答的問題。另外，文獻里報道的這些突變體（包括之前報道的基于結構為基礎的突變體，如eCas9）平行比較實驗也需要進行，如此可讓大家了解這些工具，更好地選擇最合適的工具。

實現高效的單堿基編輯一直是研究者們孜孜以求的目標，David Liu實驗室在2017年報道過一種應用于哺乳動物細胞新型的腺嘌呤堿基編輯器ABE，借此編輯器實現A？T→G？C的轉變【7】，當然其編輯效率遠低于xCas9(3.7)–BE3。而中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康研究組在水稻中開發了一種新的腺嘌呤堿基編輯器ABEP2，其識別靶位點依賴于SaCas9（PAM序列NNGRRT），能夠對水稻基因組的多個目標基因位點同時進行高效的堿基替換，甚至某些位點的編輯效率達61.3%，而且ABEP2精確性也很高【8】?？傊?，單堿基編輯器對精準編輯目的基因的研究意義非凡，就目前而言xCas9(3.7)–BE3無疑是 “利器”。

隨著不同國家、不同地域的研究者們在CRISPR領域孜孜探索，人類基因組編輯技術的發展日新月異，新的方法和工具層出不窮。我們希望研究者們能夠解析xCas9 3.7活性、保真性、PAM序列靈活性三者能夠同時得到優化的機制，相信在此基礎上，會有更快速、簡便、高效、精準的基因編輯技術出現，被更廣泛應用于疾病診療上、動植物育種等方面。但是，現有的技術水平距離人類基因編輯的需求仍有一定的距離，而xCas9 3.7（由SpCas9進化而來）的出現猶如利刃出鞘，將會極大地促進基因組編輯領域的進程。

這里需要提及的是，多種各具特色的Cas9中，在體內有優勢的是SaCas9 (staphylococcus aureus Cas9)。2015年張峰實驗室首先確定了SaCas9在哺乳動物細胞中的基因編輯作用，并對晶體結構進行了詳細的分析。它的基因長度為3300bp，比SpCas9減少了約25%，這有助于SaCas9被載入腺相關病毒（AAV），增加了基因治療應用的潛力；它識別的PAM是NNGRRT（N指A、T、C、G；R指A、G），在切割活性和靶向精準度上的表現均不輸于SpCas9【9，10】。筆者實驗室建立了雙報告系統來評估基因組編輯工具的活性和PAM【11】，分別檢測SpCas9、SaCas9和FnCpf1在不同位點上的基因組編輯活性，經過多重比較得出結論——SaCas9擁有比SpCas9和FnCpf1更高的活性【12】。因此，SaCas9憑借其分子量小和活性高的特點，在基因編輯應用中占據優勢，更為簡便高效。關于SaCas9的工程化改造可能對于基因組編輯為基礎的臨床治療有重大意義。

在功能基因組學上，CRISPR家族新成員Cpf1因為能夠同時完成多個基因的編輯，所以優勢很明顯【13】。國際上較為廣泛采用的AsCpfl和LbCpfl對PAM序列有較為苛刻的要求(TTTN)，極大程度上限制了Cpfl在實際應用中的靶位點的選擇【14，15】。為了增加Cpf1靶序列的選擇范圍，筆者發現FnCpf1——其識別的PAM序列更加靈活（KYTV，K為G/T，Y為T/C，V為A/C/G），在人類細胞中具有較高的基因組編輯活性，這些為人類（含其他哺乳動物）基因組編輯提供了更多的工具【16】。如果能夠進一步提高其保真性和活性，可能對于功能基因組學研究和臨床疾病治療非常有意義。另外，Cpf1家族對應的CrRNA較短，故而在工業化合成CrRNA方面更有優勢。

綜合上述，雖然xCas9 3.7的發現將讓人類具有更加“鋒利”和“通用性更強”的基因組編輯剪刀，但是它可能仍然無法做到基因組工具中“一統天下”，新的工具仍然需要研發和優化，從而實現“人定勝天”。(生物谷世聯博研Bioexcellence）