俄亥俄州立大學化學與生物工程學院的James Lee課題組發明了一種細胞納米化生物芯片，在數量級上提高外泌體生產和核酸包載效率，在靶向性和療效上大大超越目前臨床實驗正在測試的外泌體包載的基因治療藥物！這些結果發表在《Nature Biomedical Engineering》上。

外泌體是細胞內的多囊體分泌到細胞外，半徑為40-150 nm的囊泡，在生理狀態下介導細胞間通訊。作為基因治療中的核酸載體，外泌體的生物相容性好，其膜上天然表達跨膜和膜錨定蛋白，因此具有體內長循環以及跨血腦和血腫瘤屏障的優點。Nature曾在2017年報道外泌體的胰腺癌靶向治療作用。然而，僅有特定種類的細胞能夠分泌外泌體，且具有產量稀少、核酸包載量低、靶向修飾難度大等缺點。

因此，研究者們發明了一種新的細胞納米穿孔（cell nanoporation， CNP） 生物芯片：在密布直徑500nm納米孔道的芯片上培養單層的來源細胞（如鼠的成纖維細胞或樹突狀細胞），將整個裝置孵育在目標質粒DNA的緩沖液中，給予定向電流后，細胞膜受到損傷，帶負電的核酸質粒順著電勢差從納米孔道中進入細胞內。

此后，細胞開始修復膜并將目標質粒轉錄為mRNA，同時大量分泌外泌體，以排出電流強制注入的外來質粒。然而，細胞不斷拋出體外的“廢物”正是研究者所需的包含目標mRNA的外泌體。外泌體分泌活動在電穿孔8h后達到峰值，并能持續24h以上。與傳統的電穿孔（bulk electroporation）相比，CNP大大提高了外泌體產量，并將其中mRNA的載藥量提高1000倍！

CNP法生產負載目標mRNA的外泌體

對于CNP觸發外泌體釋放的機制，研究者認為與納米電穿孔導致的細胞外Ca2+內流有關，因為細胞為鈣離子螯合劑EGTA能夠減少外泌體的釋放。并且，他們觀察到納米電流通道附近溫度身高，熱休克蛋白含量增加后激活p53-TSAP信號通路，從而促進外泌體釋放。

CNP觸發外泌體釋放的機制

研究者在外泌體膜表面富集的跨膜蛋白CD47末端克隆神經膠質瘤靶向肽，用CNP技術在其中包載抑癌基因PTEN， 重新啟動突變的抑癌開關。他們發現PTEN缺陷型人U87膠質母細胞瘤細胞和小鼠GL261膠質瘤模型對CD47外泌體（Exo-T）對攝取顯著增加。

進一步評估藥代動力學，研究者發現過表達CD47的Exo-T在體內半衰期延長三倍，說明Exo-T在體內具有高度穩定性，能夠進行更長時程的循環。提示Exo-T給藥后維持有效的周期顯著延長，可減小臨床用藥頻率。

最后，研究者對Exo-T的體內療效進行評估，較非靶向外泌體和TurboFect納米載體，其穿透血腦屏障、靶向腫瘤富集的能力更強，肝臟和脾臟等其他器官的蓄積顯著更低。實驗組小鼠的平均生存時間為造膜后49天，較對照組的37天顯著延長。

CNP法制備的CD47外泌體的U87膠質瘤鼠體內靶向性和療效

Zhaogang Yang等人發明的細胞納米穿孔法，顛覆傳統先純化后載藥的外泌體制備方法，巧妙利用納米電穿孔將兩步驟合二為一，使細胞分泌的負載目標mRNA的外泌體，同時極大改善其產量、靶向性和適用性。目前，傳統電穿孔法附載短干擾RNA的外泌體臨床實驗已在進行當中，而CNP技術展現出的高靶向、低毒性的數量級突破，提示更優異的外泌體基因治療策略在臨床廣泛應用的轉化可能性。(世聯博研(Bioexcellence)世聯博研Bioexcellence）

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