CAR-T細胞療法在過去一年獲得了足夠關注，FDA連續批準了兩款CAR-T產品：諾華的Kymriah和吉利德/Kite Pharma的Yescarta。截止目前為止，國內已有五家公司的六款CAR-T產品獲批臨床。

雖然CAR-T細胞療法在CD19陽性血癌如淋巴瘤和白血病中顯示出顯著的功效，但是細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經毒性（neurotoxicity, NT）等危及生命的副作用限制了CAR-T療法的臨床應用。

近日，優瑞科生物技術公司（Eureka Therapeutics）公布其專有的ARTEMIS抗體-TCR（AbTCR）受體平臺的臨床前研究數據，證明AbTCR-T細胞與現有的抗CD19 CAR-T細胞具有一致的抗癌效力，但炎性細胞因子的產生顯著降低，減少CRS和NT的風險。

該研究于11月20日發表在Nature子刊Cell Discovery上，通訊作者是優瑞科的創始人兼首席執行官劉誠博士，費城兒童醫院的Stephan A. Grupp博士和David Barrett博士也參與了這項研究。

劉誠博士（圖片來源：Eureka Therapeutics）

對比傳統TCR-T：突破MHC限制

T細胞由其細胞表面上存在的TCR分子定義。TCR 識別異常細胞抗原，并觸發T細胞活化和隨后的腫瘤細胞裂解的級聯信號事件。在大多數T細胞中，TCR由α鏈和β鏈組成，而在1-5％的T細胞中，TCR由γ鏈和δ鏈組成。

αβ鏈（或γδ鏈）的細胞外區域負責抗原識別和結合。抗原結合通過多聚體CD3復合物刺激下游信號傳導，該復合物與αβ（或γδ）鏈的細胞內結構域結合為三聚體（εγ、εδ、ζζ）

不輸于CAR-T，TCR-T細胞療法是目前一個活躍的研究領域，并且已經在臨床試驗中獲得不錯的療效。該療法通過分離腫瘤特異性TCRα和β鏈并將其克隆到轉導載體中，轉導T細胞以產生腫瘤抗原特異性T細胞。

然而，目前大部分TCR-T療法的靶標受MHC（主要組織相容性復合物）限制。此外，外源性與內源性αβ鏈之間存在雜交（錯配）風險，可能誘導自體抗原的有害識別，導致移植物抗宿主病。

左起：內源TCR、工程化TCR、兩種可能雜交（錯配）TCR的結構（圖片來源：biologists）

AbTCR的結構（圖片來源：Cell Discovery）

優瑞科的AbTCR設計將抗體的Fab結構域與來自γδ TCR的效應結構域融合，將抗體識別的親和力和特異性與T細胞的腫瘤細胞毒性潛力相結合。既可以利用內源性TCR信號傳導途徑，同時通過使用TCR-mimick（TCRm）抗體靶向肽-MHC復合物或使用常規抗體靶向細胞外抗原，具有靈活性。

TCR-mimick抗體

Eureka研發的針對胞內抗原肽/MHC復合體靶點的治療性抗體，在業界也被稱為TCR-mimick抗體、TCRm抗體或TCR樣抗體。

雖然大多數以胞內抗原為靶點的方法都涉及到可穿透細胞的化合物，但是TCRm是從細胞外部起作用。其技術原理概括如下：Eureka專有抗體技術開發平臺通過靶向MHC/免疫肽段復合物來發現識別腫瘤細胞內的特異性抗原。這些抗體因而能有效識別癌細胞內的特異蛋白質，然后調動免疫系統攻擊相關腫瘤細胞。                                 

與TCR-T平臺類似，AbTCR能夠與CD3復合物結合，使得抗原/AbTCR參與觸發內源性T細胞活化和調節途徑。然而，與大多數TCR-T平臺不同的是，基于γδ TCR的細胞內結構域和用于靶識別的抗體結合部分，AbTCR平臺能夠擴展到非MHC限制的目標（例如CD19），并且避免了與T細胞內源性αβTCR的錯配風險。

此外，γδ TCR亞基對CD3具有比αβTCR更高的親和力，有利于增強下游轉導信號。

有望降低CRS、NT風險

CAR-T和TCR-T這兩種技術的一個共同點在于通過基因改造的手段提高T細胞受體對特異性癌癥細胞抗原的識別能力和進攻能力。

通常地，CAR由來自mAb的單鏈可變片段（scFv）、細胞外間隔區（稱為鉸鏈）、跨膜結構域、CD3ζ信號傳導結構域和通常一或兩個（第二代或第三代）共刺激結構域組成。CAR賦予T細胞以不依賴于MHC的方式通過scFv（抗體識別）直接結合表面抗原的益處，并通過CD3ζ和共刺激結構域同時向T細胞傳遞信號。

CAR的結構（圖片來源：Science）

然而，抗原識別與細胞激活結構域的直接融合產生合成激活信號，其可能不同于內源性TCR-CD3復合物介導的細胞激活信號。

CRS是與靶抗原結合后CAR-T細胞不受控制的過度刺激的結果。在CAR-T細胞中，信號傳導結構域（CD3ζ）和共刺激結構域（CD28或4-1BB）融合到CAR受體構建體中。與靶抗原（例如CD19）結合后，CAR-T細胞激活并在殺死癌細胞的過程中分泌細胞因子。然而，細胞因子不受控制的產生可導致CRS和NT等副作用。

AbTCR不利用CD3ζ與CD28/4-1BB融合，相反，它包含Fab片段的基于抗體的抗原結合結構域，所述Fab片段被工程化到γδ TCR鏈的效應結構域上。理論上，這允許AbTCR形成與內源性CD3鏈的多聚T細胞信號傳導復合物，利用自然激活和TCR受體的調節途徑，以控制細胞因子的產生。

細胞水平上的表征：AbTCR-T具有治療潛力

為了進行功能上的表征，優瑞科的研究人員開發了人抗CD19抗體（ET190L1），并比較了ET190L1-AbTCR-T細胞和ET190L1-CAR-T細胞（使用CD28和CD3ζ）在抗原刺激前后的表型。

>>>>抗原刺激前

在制造期間，ET190L1-AbTCR-T細胞以與ET190L1-CAR-T細胞相似的生長動力學擴增，并產生具有相似轉導效率和CD4：CD8比率的T細胞群。

已發表的CAR-T臨床研究的回顧性分析發現，初始（na?ve）程度更高、分化和衰竭程度更低的T細胞與療效提高有關。

有趣的是，在CD3/CD28擴增后、抗原結合之前，與ET190L1-CAR-T細胞相比，更大比例的ET190L1-AbTCR-T細胞顯示出初始（TN）和干細胞記憶（TSCM）T細胞表型。CD8 + AbTCR-T細胞上的CD28表達增加、顆粒酶B（GranB）減少、CCR7增加，表明用AbTCR工程化的T細胞分化較少。此外，AbTCR-T細胞上表達的衰竭標志物PD-1和TIM-3低于CAR-T細胞。

研究人員驚訝于觀察到抗原結合前的差異，因為兩種細胞都表達相同的抗原特異性Ab可變序列。他們認為對這種差異最可能的解釋是已經報道的基于CD137和CD28的CAR-T細胞的滋養型（tonic）信號。

>>>>抗原刺激后

研究表明，ET190L1-CAR-T細胞和ET190L1-AbTCR-T細胞以抗原依賴性方式觸發T細胞活化，僅特異性裂解CD19陽性腫瘤細胞系，同時，兩者響應于抗原的增殖動力學、細胞毒性和脫顆粒作用相當。

相比ET190L1-CAR-T，ET190L1-AbTCR-T細胞在體外介導抗原特異性應答（圖片來源：Cell Discovery）

在腫瘤細胞裂解期間，與CAR-T細胞相比，腫瘤刺激的AbTCR-T細胞上活化標記物CD69和CD25的表達只是略有增加，但與CAR+ CD4+相比，AbTCR+ CD4+細胞表達的衰竭標記物PD-1水平顯著降低，并且在CD4+和CD8+ AbTCR-T細胞中，LAG-3也顯著降低。

此外，雖然兩種細胞具有相當的細胞毒性和增殖潛力，但16小時體外殺傷試驗表明，AbTCR-T細胞釋放較低水平的炎性細胞因子，包括TNF-α、IL-2、IFN-γ和GM-CSF。

AbTCR-T細胞釋放較低水平的炎性細胞因子（圖片來源：Cell Discovery）

先前，TCR-T和CAR-T細胞之間的比較已經表明，通過TCR的活化可以相對減少細胞因子釋放，同時增加抗原敏感性。

雖然AbTCR沒有共價連接的CD28共刺激結構域，但研究中的淋巴瘤細胞（Raji細胞）通過表達CD80和CD86可以為CAR-T細胞和AbTCR-T細胞提供CD28共刺激。因此，研究人員認為AbTCR和CAR之間的細胞因子分泌和衰竭的差異源于AbTCR受體的γδ TCR效應結構域對內源信號傳導途徑的利用。

臨床上已廣泛研究的抗CD19 CAR-T細胞CTL019（Kymriah的研究級版本）具有CD137（4-1BB）共刺激結構域，通過比較發現，ET190L1-AbTCR-T細胞相比CTL019同樣釋放較低水平的TNF-α、IL-2、IFN-γ和GM-CSF。

相比CTL019，ET190L1-AbTCR-T細胞釋放較低水平的炎性細胞因子（圖片來源：Cell Discovery）

異種移植模型：抗癌效力不減、CRS風險降低

為了測試減少的細胞因子釋放是否對體內抗腫瘤活性有影響，研究人員使用原發性B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）（CHP105R1，CD80和CD86均為陰性）患者來源的異種移植物（PDX）小鼠模型，并觀察到用ET190L1-AbTCR-T和CTL019-T細胞處理的小鼠之間相似的腫瘤抑制。

因此，與上述使用Raji細胞的體外研究一致，AbTCR工程化的T細胞可以減少細胞因子釋放而不喪失抗腫瘤活性。

異種移植小鼠模型結果（圖片來源：Cell Discovery）

類似地，人CD19+ Raji B細胞淋巴瘤異種移植模型中，ET190L1-AbTCR和ET190L1-CAR治療均使腫瘤消退和長期腫瘤排斥。

在模擬T細胞處理的小鼠（對照組）必須被安樂死時，ET190L1-CAR-T細胞處理的小鼠的腫瘤負荷比模擬處理的小鼠平均降低~1000倍，而用ET190L1-AbTCR-T細胞處理的小鼠平均降低~5300倍。

在T細胞清除初始腫瘤負荷幾周后，研究人員用腫瘤細胞重新注射小鼠來測試存留的ET190L1-AbTCR-T細胞阻止“新引入的”腫瘤細胞生長的能力。研究表明，雖然腫瘤在對照小鼠中快速生長，但先前用AbTCR-T細胞或CAR-T細胞處理的小鼠對Raji淋巴瘤再攻擊具有抗性。

體外細胞因子釋放和T細胞衰竭標志物的分析結果與體外研究相一致。

ET190L1-CAR治療引起炎性細胞因子（包括IL-2，IL-10，IFN-γ和TNF-α）的顯著升高，而在ET190L1-AbTCR處理組中，這些細胞因子的水平顯著低于ET190L1-CAR處理組。給藥后9天和15天從外周血收集的T細胞顯示，AbTCR-T細胞表達的PD-1水平顯著低于CAR-T細胞。

總之，這些數據顯示：

AbTCR-T細胞表現出有效的體外和體內抗腫瘤活性，但釋放較低水平的炎性細胞因子并表達比CAR-T細胞更低水平的衰竭標志物。

Stephen A. Grupp博士說：“這些數據向更安全的T細胞療法邁出了關鍵一步。CRS和相關不良事件仍然是今天使用CAR-T療法的醫生的主要挑戰，令人興奮的是，優瑞科的ARTEMIS技術具有克服這些問題的潛力。”

優瑞科的創始人兼首席執行官劉誠博士說：“傳統觀念認為，CRS是CAR-T療法功效的不可避免的副作用。我們已經證明，療效和CRS有可能脫鉤。更安全的T細胞治療可以為患者帶來更大的治療窗，同時降低患者和整個醫療保健系統的直接和間接成本。”（生物谷Bioon.com）

小編推薦會議 2019（第十屆）細胞治療國際研討會

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