applied DNA Sciences子公司LineaRx通過專有的非病毒、無質粒平臺（non-viral， plasmid-free ；NVPF）在人類CAR-T細胞中實現抗CD19表達，開創(chuàng)新一代更快、更經濟的細胞治療藥物。

據該公司所知，這一開創(chuàng)性的事件首次表明人類T細胞利用可擴展PCR（聚合酶鏈式反應）制造工藝生產的線性DNA從基因構建體表達抗CD19 CAR。該公司將這一進展視為目前所有使用病毒遞送平臺基因療法的一個重要選擇，尤其是使用病毒傳遞合成基因來重定向患者T細胞的免疫腫瘤療法，即CAR療法。

LineaRx獨特的PCR的制造技術創(chuàng)造了編碼抗CD19銜接器的線性DNA擴增子，然后將該構建體通過離體電穿孔到人T細胞中，隨后的測試顯示從這些工程細胞中產生抗CD19表達。雖然這些初步數據令人鼓舞，但總體表達水平最初較低，LineaRx將繼續(xù)致力于使用正在申請專利的高表達擴增子（HEA？）和除電穿孔以外的轉染方法產生更高的轉染水平，并將報告這一重大成就的進一步進展。

如立體模式圖顯示，當細胞通過“電轉區(qū)”時，施加脈沖，電場線通常不將絕緣的細胞穿透，而是通過導電孔穿過細胞。

目前，電穿孔技術已廣泛應用于生物技術、基因工程、臨床醫(yī)學等多個領域。比如，利用電穿孔實現基因轉染、細胞融合、將外源蛋白質分子插入細胞膜、激活細胞膜的傳輸因子、提高酶的活性、提高藥物進入細胞的能力、以及增強癌癥的化療效果等。

成功的細胞轉染關系到眾多生物醫(yī)學研究以及生物產業(yè)鏈，包括細胞療法、RNA干擾、以及干細胞研究。非病毒方法的外源載體轉染技術面臨的主要挑戰(zhàn)在于不夠穩(wěn)定的、低下的轉化效率，尤其是原代細胞系、干細胞系這類難轉株。電穿孔技術的一個傳統(tǒng)瓶頸在于，如何以不犧牲細胞生存能力為前提，取得高效的轉化率。成功的電轉技術涉及了電場、緩沖參數等方方面面的優(yōu)化，需要考慮到不同的細胞系、分子負載等，以達到轉化效率和細胞損傷量的理想平衡。如此而來，一個成功的電轉技術的可能經歷過反復失敗，并且很可能在另外一個實驗室或另一項應用中將無法重復。

這一成就建立在另一個第一個工程人類T細胞的基礎上，通過線性DNA擴增子在2018年末通過LineaRx的PCR技術生產、設計和制造，證明了一個線性DNA擴增子，其中含有編碼綠色熒光蛋白產生的完整基因（GFP），如在顯微鏡圖像中所見，通過高通量電穿孔促進了PCR產生的GFP基因片段在數百個人T細胞中的攝取和隨后表達，產生了綠色熒光細胞的亮點。

LineaRx認為NVPF CAR-T制造平臺比現有的基于病毒/質粒的CAR-T平臺具有許多潛在優(yōu)勢，包括：

簡化的生產流程將降低成本和縮短交貨時間，通過縮短“靜脈對靜脈”的時間減少病人的發(fā)病率和死亡率。

降低永久性遺傳整合/重組進入靶細胞的風險，降低插入誘變的風險

目前一些CAR-T細胞治療副作用的潛在緩解，如細胞因子釋放綜合征（CRS）和靶向腫瘤外毒性

靶向新抗原的最終能力（足以快速影響患者）或個體患者癌癥中產生的特異性蛋白質突變，以及癌癥以外的其他疾病表現，這將使患者的免疫系統(tǒng)成為多種治療手段的工具

最終能夠在護理點開發(fā)CAR-T療法，避免復雜和繁瑣的供應鏈，從而加速治療

applied DNA總裁兼首席執(zhí)行官James A. Hayward博士表示： “我們的目標有三個方面：1）作為快速設計和生產治療性核酸構建體的平臺，建立包括在護理點的PCR產生的線性DNA的價值； 2）證明不同于全行業(yè)病毒生產的NVPF生產流程具有更高的安全性和治療價值；3)與未來的合作伙伴將我們基于NVPF的抗CD19 CAR T細胞治療帶到臨床。”

2018年10月，LineaRx宣布與iCell基因治療公司簽署了一項北美獨家授權和研究服務協議，用于抗CD19 CAR-T治療的研究。LineaRx利用applied DNA在大規(guī)模PCR生產和DNA化學修飾方面的專長及其NVPF平臺開發(fā)和生產CAR-T治療的表達載體，包括其非病毒、無質粒抗CD19 CAR-T候選藥物LinCART19？。

在不使用病毒載體或質粒的情況下，LineaRx的NVPF制造平臺與現有的基于病毒/質粒的CAR-T方法相比具有許多潛在優(yōu)勢，若成功則可以為患者提供了更高效，更實惠和更安全的基因療法。

目前，這些初步數據令人鼓舞，但總體表達水平最初較低，LineaRx將繼續(xù)致力于使用正在申請專利的高表達擴增子（HEA？）和除電穿孔以外的轉染方法產生更高的轉染水平，并將報告這一重大成就的進一步進展。

未來，該公司是否能實現比現有的基于病毒/質粒的CAR-T平臺的潛在優(yōu)勢，我們拭目以待！(世聯博研(Bioexcellence)世聯博研Bioexcellence）

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