細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由細胞分泌的具有雙層磷脂膜結構的囊泡小體，絕大多數細胞均可分泌。細胞外囊泡中可以攜帶蛋白質、脂質和核酸等多種生物活性成份，介導體內細胞間遠程通訊【1】。根據大小分類，EVs可以分為直徑小于200納米的sEVs(small extracellular vesicles)和直徑大于200納米的lEVs(Large extracellular vesicles)。根據其來源分類，細胞外囊泡主要可以分為來源于多囊泡體(multivesicular endosomes，MVEs)的外泌體(Exosomes，30-50 nm)和來源于細胞質膜(Plasma membrane)的微體(Microvesicles，100-1000 nm)【2】。

隨著外泌體的研究的增加，人們逐漸發現，在外泌體樣品(“exosomal” samples)中不僅僅包含sEVs，同時還會混雜著“不含膜性結構”的NV組分(non-vesicular compartments)。而NV組分帶來的異質性往往會對外泌體組成成分及功能的研究產生干擾和混淆。目前，分離純化細胞外囊泡的方法主要有四類，即超高速離心法、過濾法、沉淀法和免疫富集法。這些分離方法沒有明確的將sEVs與NV組分分開，因此可能會對后續的分析產生干擾。同時，目前鑒定出來可以作為外泌體標記物的經典分子有CD63、CD81和CD9【3】，然而還沒有發現進一步區別微體和外泌體的特異標記物。

2019年4月4日，來自美國范德堡大學醫學中心的Robert J. Coffey課題組在Cell發表題為Reassessment of Exosome Composition的研究，研究人員通過高分辨率密度梯度離心結合免疫親和捕獲的技術將外泌體從NV組分中分離，并發現Ago1-4以及MVP蛋白的分泌不依賴于外泌體，并且Annexin A1可以做為來源于細胞膜的微體的標記物以區別于來源于內體的外泌體。同時，細胞外DNA的分泌并不依賴于外泌體，而是依賴于內吞自噬融合體介導的途徑。

首先，研究人員使用傳統的差速離心的方法分離了DKO-1細胞系和膠質母細胞瘤細胞(Gli36)的lEVs(P15)和sEVs(P120)，再通過高分辨率密度梯度離心(High-Resolution Density Gradient Fractionation)進一步分離得到的包含有sEVs的P120組分。通過檢測CD63和CD81表明，該實驗采用的高分辨率密度梯度離心可以很好的將sEVs和NV組分分離。

接下來，研究人員通過液相色譜-質譜串聯技術以及RNA-seq技術分別分析sEVs和NV組分中的蛋白和細胞外RNA成分，發現之前認為很多存在于外泌體組分中的蛋白及RNA其實更多的存在于NV組分中。

在RNA結合蛋白方面，研究人員通過“直接”免疫親和捕獲技術(Direct Immunoaffinity Capture，DIC)發現，包括miRNA結合蛋白Ago1-4以及hnRNPA2B1、GAPDH和穹窿體主蛋白(major vault protein，MVP)等的分泌并不依賴于外泌體。同時，包括丙酮酸激酶(pyruvate kinase M1/2，PKM)在內的糖酵解酶和細胞骨架蛋白以及與外泌體生成有關的RAB GTPase等也不在外泌體組分中。

在膜結合蛋白方面，研究人員通過改變密度梯度離心的組分并且結合SIM(Structured illumination microscopy)成像，發現Annexin A1和A2標記的EVs能夠很好的區分于經典的外泌體，同時Annexin A1能夠作為來自細胞質膜的微體的標記物。

在之前的研究中，外泌體被報道含有雙鏈DNA(double stranded DNA，dsDNA)以及組蛋白【4-5】。然而，在這項研究中，研究人員發現雙鏈DNA和組蛋白更多的位于NV組分中，而不是外泌體或者sEVs中。進一步通過SIM成像，研究人員發現雙鏈DNA和組蛋白定位于CD63和LC3B陽性的內吞自噬融合體(amphisomes)中，并且能夠出現在細胞質膜的部位。因此，研究人員提出DNA分泌是依賴于自噬和多泡內體，而不依賴于外泌體。

總之，該研究通過高分辨密度梯度離心以及“直接”免疫親和捕獲兩種技術手段的結合，將sEVs與細胞外NV組分分開，從而更精確地鑒定了以CD63、CD81和CD9為標記物的經典外泌體中的蛋白和RNA等分子組分，為細胞外囊泡的異質性提供了更深入的認識，同時為將來通過細胞外囊泡進行疾病診斷和治療提供了重要的幫助。(生物谷Bioon.com）

小編推薦會議  2019（第四屆）外泌體與疾病研討會

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