肺癌作為一種高度致死性的惡性腫瘤，占所有新增癌癥病例的13.2%，占所有癌癥相關死亡的25.9%，平均5年生存率18.1%。此外，大量臨床數據也表明，早期肺癌患者術后五年生存率要明顯高于晚期肺癌患者。外泌體是具有脂質雙層膜結構、直徑為30～100nm的微小囊泡，是細胞經過“內吞-融合-外排”等一系列調控過程后由細胞主動分泌的一種物質。雖然幾乎機體內的所有類型細胞都能夠分泌外泌體，如：網織紅細胞、樹突狀細胞、內皮及上皮細胞等，但近些年來的研究顯示，體內不同細胞分泌的外泌體，特別是肺癌細胞來源的外泌體，不僅可以調節自身細胞的增殖和遷移，還可以影響其他細胞的生理功能，進而調控肺癌的發生發展。Munson等發現，外泌體所攜帶的生物活性物質可能作為腫瘤診斷和預后的標志物。因此，本文就近年來外泌體在非小細胞肺癌（NSCLC）的發生發展、早期診斷、治療及預后方面的研究進展進行綜述。

1.外泌體概述

外泌體是在研究網織紅細胞的成熟過程中被Johnstone等人發現并命名的。外泌體是一種球形的納米級細胞外囊泡，直徑30～100nm，密度1.13～1.19g/ml。在生理和病理條件下，外泌體都可以被一些細胞以胞吐的方式所釋放，如：免疫細胞、干細胞、腫瘤細胞，并且其廣泛分布于各種體液中，如：尿液、唾液、血液、羊水、腦脊液及病理性腹水等，同時，由于其起源于相應的母細胞，故腫瘤細胞來源的外泌體有望成為一種全新的非傾入性檢查替代以往的組織活檢技術。

外泌體的組成較為復雜，其內含有多種生物大分子，如：核酸（雙鏈DNA和各種RNA亞型）、蛋白質和脂質。這些分子被外泌體攜帶進入血液循環，而后被靶細胞吸收，從而調節靶細胞基因表達和細胞功能。此外，外泌體相關的miRNA作為短單鏈和非編碼RNA分子，調節致癌基因或抑癌基因的表達，參與細胞分化、細胞凋亡及細胞信號的傳導。有研究表明，外泌體能影響腫瘤微環境的形成、增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力、介導腫瘤免疫抑制及參與腫瘤放化療抵抗進而促進腫瘤的發生發展。

2.外泌體在肺癌進程中的作用

肺癌細胞來源外泌體（LCC-exosome）可以通過刺激腫瘤血管的形成來促進腫瘤的生長。據相關報道稱，LCC-exosome中的miR-210可以通過調節基質細胞中酪氨酸受體激酶A3的含量，促進腫瘤血管的生成；而LCC-exosome中的miR-23a則可以通過激活脯氨酰羥化酶及抑制緊密結合蛋白ZO-1來促進肺癌的生血管作用。此外，有研究發現，外泌體中的內容物可以觸發上皮-間質轉化（EMT）。晚期肺癌患者血清中外泌體波形蛋白表達增加，促使人正常支氣管上皮細胞出現EMT，從而使肺支氣管正常上皮細胞出現增殖，遷移能力。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞來源的外泌體能夠誘導CD4+T分化為調節性T細胞，抑制機體的抗腫瘤免疫反應；肺癌細胞分泌的外泌體含有miR-21和miR-29a，可在免疫細胞中結合并激活TLR8，使TLR介導的NF-κB信號通路活化，從而導致腫瘤的生長和轉移。在肺癌的侵襲和轉移過程中，細胞間通訊扮演著重要的角色。據有關報道稱，NSCLC分泌的外泌體內TGFβ和IL10的高表達與肺癌的轉移密切相關。此外，激活的T細胞可以通過調控Fas信號通路增加基質金屬蛋白酶9（MMP9）的表達，進而促進肺癌的轉移。這些機制有望成為肺癌治療的潛在靶點。雖然大多數外泌體都是促進腫瘤的侵襲與轉移，但也有報道稱，外泌體miR-302b可以通過抑制TGFβRⅡ來抑制肺癌細胞的轉移與增殖。

3.外泌體在肺癌早期診斷中的作用

3.1外泌體相關miRNA與肺癌的診斷

miRNAs是一類含有20～25個核苷酸的非編碼小RNA，能夠通過下調或抑制靶mRNAs來調節轉錄水平上的基因表達，目前非編碼RNA被普遍發現存在于NSCLC患者外泌體中，參與腫瘤的形成和演化過程。單個miRNA可能通過抑制性復合物與多個mRNA結合，從而阻滯整個生物通路。因此，外泌體的miRNA具有成為NSCLC標志物的優勢。Chen等在152例肺癌患者的研究中首次報道了循環游離miRNA的表達，與75例健康者相比，發現了兩種高表達的miRNA（miR-25和miR-223）。Rabinonowits等對27例肺癌患者和9例健康人的血漿外泌體中12個miRNA的表達進行了評估，結果顯示，12個腫瘤相關的miRNA僅在肺癌患者中過度表達。Cazzoli等收集了30個血漿樣本，發現4種外泌體miRNA（miR-378a、-379a、-139-5p、-200b-5p）在肺癌患者血清中明顯升高，用于篩查患者與健康人ROC曲線下面積（AUC）為0.908。進一步研究發現，另外6種外泌體（miR-151a-5p、-30a-3p、-200b-5p、-629、-100、-154-3p）可用于肺癌的診斷，其AUC為0.76。這些miRNAs具有NSCLC早期診斷的高度敏感性，有望成為NSCLC早期診斷篩查的生物標志物。

在臨床應用方面，目前Exosome Diagnostics公司研發的基于血漿外泌體的ALK試劑盒已于2016年初被美國FDA批準用于臨床。這是世界上第一個以血液樣本分析外泌體RNA的臨床液體活檢。這項方法可以準確、實時地檢測NSCLC患者的EML4-ALK突變，通過比較NSCLC患者組織ALK水平和相應的血漿樣本發現該項檢測可以達到88%的診斷靈敏度和100%的診斷特異性。而此前，對于EML4-ALK的檢測是基于組織活檢的FISH或IHC，而且，FISH缺乏靈敏性，誤診率也較高。

3.2外泌體相關蛋白質與肺癌的診斷

近年來眾多文獻報道，肺癌細胞分泌的外泌體中富含多種蛋白質并促進肺癌的發生發展，是早期診斷肺癌的有效途徑。有研究發現，NSCLC患者肺組織外泌體表面EGFR免疫染色呈陽性的占80%，而慢性肺炎組織的外泌體EGFR呈陽性的只占2%，因而認為外泌體的EGFR蛋白可以用作NSCLC與慢性肺炎鑒別診斷的生物標志物。Park等通過Sys-BodyFlu-id數據庫分析發現153種特異性胸腔積液外泌體蛋白質，進一步的Western blotting分析顯示多種特異性胸腔積液外泌體蛋白參與EGFR信號傳導途徑以促進腫瘤的發生發展，因此外泌體蛋白可能作為肺癌診斷篩查的生物學標記物。

近年來，高通量質譜分析被廣泛地應用于篩選NSCLC外泌體蛋白的研究，這為我們揭示了更多具有生物標志物價值的分子。Birgitte等采用微陣列芯片技術研究了431例肺癌患者和150例對照者血漿外泌體中的蛋白表達情況，發現CD151、CD171和TSPAN8這三種蛋白表達不僅能區分腫瘤與正常組織，同時也能區分各種肺癌的組織亞型。此外，聯合應用這三種蛋白診斷NSCLC的AUC達到0.74。Clark等采用納升液聯用技術（nano-ESI-LC-MS/MS）分析了來自正常支氣管上皮細胞系和兩個攜帶NSCLC細胞系的外泌體的蛋白表達譜，從中篩選出如細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子、溶酶體膜糖蛋白2等多種存在顯著性差異表達的蛋白，同時檢測分析這些蛋白有助于提高NSCLC診斷的敏感性和特異性。

4.外泌體在肺癌治療中的作用

目前外科手術仍是肺癌治療的最有效方法，但術后復發率很高，而傳統放化療對肺癌的治療效果又極其有限。因此，肺癌治療的新模式受到廣大研究者的關注，已有大量研究證明外泌體在肺癌治療中有廣闊的應用前景。

外泌體作為細胞間通訊的一種形式，在肺癌的進程中具有重要作用，因此，控制外泌體的分泌可能成為治療肺癌的潛在靶點。據相關報道稱，EPI64可以通過激活特異的GAP和Rab27A來控制A549肺癌細胞的外泌體分泌，提示EPI64可以作為治療的潛在靶點。此外，CD9、CD63、HSP90和HSP70在外泌體中富集，從而上調主要組織相容性復合物Ⅱ類分子表達水平，顯著促進CD4+T細胞的增殖，通過免疫途徑抑制腫瘤。理論上，所有促進肺癌細胞分泌外泌體的機制都可以被用來作為肺癌治療的潛在靶點，但目前關于其可行性的研究還比較少。有研究表明，腫瘤來源的外泌體對腫瘤免疫的調控具有一定的影響作用，包括免疫抑制和免疫激活兩個方面。Romagnoli等研究發現，肺癌細胞可以刺激樹突狀細胞等抗原提呈細胞產生攜帶特異性癌抗原的外泌體，這些外泌體可以遷移到區域淋巴結，進而激活CD4+T與CD8+T細胞產生抗腫瘤免疫反應，進而抑制腫瘤生長。Besse等研究發現，在晚期NSCLC患者中，裝載有IFN-γ，MHC I和MHCⅡ限制性癌抗原的樹突狀細胞外泌體增強了NK細胞的抗腫瘤免疫功能，研究證實外泌體參與相關腫瘤生理病理過程，在NSCLC免疫治療中有著重要的臨床應用價值，為NSCLC的治療打開了新的視野。

此外，外泌體作為藥物遞送載體較以往的合成系統具有多方面的優勢，比如：人工遞送載體具有更低的免疫原性，其含有的磷脂雙分子層可與靶細胞細胞膜融合，從而避免單核巨噬細胞系統的吞噬作用。Srivastava等開發了一種基于外泌體-金奈米粒子（Exo-GNP）的藥物遞送系統—“nanosomes”用于肺癌的治療，研究表明該系統與單用多柔比星治療相比，前者的多柔比星釋放量增加、攝取率提高、化療毒性降低且化療效果增強。此外，還有研究發現，使用外泌體運載紫杉醇（PTX）可顯著提高癌細胞對PTX的吸收，將PTX加載至外泌體中顯著增加了藥物細胞毒性，Exo-PTX能顯著抑制肺癌的發展。Aqil等在進行裸鼠實驗時發現，加載至外泌體中的雷公藤紅素（Exo-CEL）比普通的CEL有更強的抗腫瘤功效，且在小鼠中未發現明顯全身性或系統性毒性，由此可以證明，外泌體制劑可以有效增強CEL功效并降低與劑量有關的毒性。到目前為止，外泌體在肺癌治療方面的研究主要集中于免疫抑制，有效的外泌體藥物遞送平臺的搭建以及外泌體相關的潛在治療靶點的探索。已有的研究表明外泌體在肺癌治療領域有著廣闊的前景，期待外泌體在肺癌治療領域早日得到突破，造福更多的患者。

5.外泌體與肺癌預后

外泌體mirRNA和蛋白質被認為是NSCLC的預后因子。Dejima等在研究NSCLC患者預后的生物標志物時發現，外泌體miR-4257和miR-21的含量顯著上升。此外，還有研究表明，低水平miR-146a-5p的NSCLC患者較高水平miR-146a-5p的NSCLC患者有更高的復發率。Sandfeld-Paulsen等在研究276例NSCLC患者血漿的外泌體時發現，NY-ESO-1是唯一對低生存率有顯著影響的標志物。Silva等利用TaqMan低密度芯片的方法系統分析了28位NSCLC患者體內的365種miRNA，其中let-7f、miR-30e-3p和miR-20b表達均下調，進一步研究發現，let-7f和miR-30e-3p水平可以區分早期和晚期NSCLC患者，高水平let-7f和miR-30e-3p與不良預后密切相關。

在當代精準醫療的大趨勢下，外泌體的發現和研究為肺癌的早期診斷和治療提供了嶄新的方向。外泌體在液體活檢中的巨大潛力可以為肺癌患者的早期發現和早期診療提供可靠依據。根據腫瘤來源的外泌體在肺癌的發生發展和侵襲轉移過程中的作用及相關機制的研究，臨床醫療人員可以針對不同的患者制定最合適的治療方案，以達到改善肺癌患者生存率，延長肺癌患者生存時間的目的。但是，針對外泌體的研究還存在諸多的問題有待廣大研究者解決，如：外泌體的純化及標記方法、如何尋找外泌體的靶基因、外泌體的作用機制及信號通路等。總而言之，外泌體的研究有著廣闊的前景，基于外泌體與肺癌的研究，有望研發出能夠應用于肺癌臨床診斷和治療的有效措施，造福更多的患者。(生物谷世聯博研Bioexcellence）

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