| 實驗設計/技術服務導航 | |||||||||
|
|||||||||
|
|||||||||
| 新藥研發CRO | |||||||||
|
|||||||||
|
|||||||||
實時熒光定量PCR技術服務(Real Time-PCR,RT-PCR)
實時熒光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服務
世聯博研生命科學服務中心提供快捷高效的實時熒光定量PCR(Real Time PCR,RT PCR)服務，所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。是一個常用的mRNA水平的基因表達定量技術。
服務內容
- 細胞/組織的基因差異表達檢測，經過不同處理樣本之間te定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，te定基因在不同時段的表達差異以及cDNA芯片或差顯結果的確證。
- 組織/細胞樣品中基因拷貝數的確定，DNA或RNA的相對和絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。
- 基因分型，基因突變及多態性方面的研究。
收費標準
- 抽提樣品DNA或RNA：細胞樣品 40元/樣本；組織樣本 60元/樣本
- 引物/TaqMan探針設計與合成：you化引物/探針設計及合成 （探針法）每個基因 1100元；you化引物設計及合成 （染料法）每個基因 100元
- RT反應：RNA反轉錄成cDNA 25元/樣本
- 預實驗：熒光PCR體系you化。確定熒光PCR反應條件300元/基因
- 標準曲線制作：標準品為PCR產物300元 標準品為質粒400元
- 正式實驗：熒光PCR檢測。30元/反應
服務周期
1. 從細胞或te定組織中提取總RNA：實驗周期為細胞或組織送到后的2個工作日。
2. 逆轉錄實驗：實驗周期為1個工作日。
3. 擴增內參和目的基因，實驗周期為10個工作日。因為在每種不同細胞或組織中不同的基因的擴增難度有差異，因此實驗的時間會有所不同。我們一般會根據實驗進程通知客戶，確保客戶在時間知道實驗狀況。
4. 回收內參和目的基因表達片段做標準樣，并檢測其擴增效果： 實驗周期為2個工作日。
5. 上機Real Time-PCR檢測得到結果并進行處理： 實驗周期為2個工作日。
客戶須知
1. 進行mRNA表達量分析時，如果提供的材料為Total RNA，請寄送足量的并且保證純度的Total RNA(濃度在200 ng/μl以上，體積在20 μl 以上，純度A260/280在1.8-2.0間)。如果目的基因表達量低時，應盡量提供更高濃度的Total RNA。
2. 如果提供的材料為細胞或組織，DNA、RNA的提取費用另收（參照DNA/RNA抽提服務）。 同時應保證材料新鮮，動物細胞數為106以上，動物組織為100 mg以上。
3. 目的基因信息(GenBank Acc、Gene ID、關鍵詞)，mRNA需說明具體剪接子及檢測范圍（公共區域或te異性區域）。
4. 引物設計的區域范圍(序列、5′端序列、3′端序列)。我們可免費提供引物和TaqMan探針設計服務，合成費用由客戶支付。
5. 確定準確的靶序列數量，以準確定量的靶序列作為參照，好是以質粒的形式提供。檢測工作完畢后，本公司會將檢測結果和相關圖片反饋給客戶。
6. 客戶應對所提供的材料及信息負責，如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。
服務程序
1. 可在我公司網站內直接填寫《Real Time-PCR服務訂單》發至我公司郵箱。
2. 可下載訂單，填寫完成后，用傳真的形式發到我公司。
3. 可電話聯系詳談有關具體要求和服務內容。
4. 簽訂《Real Time-PCR服務合同》，預付實驗總費用的50%作為實驗預付款。
5. 寄送：委托單位的試驗材料和試劑等均須采用te快專遞形式郵寄，有低溫要求的、固定要求的，按低溫保存、固定防碎方法運輸，以確保實驗物品的安可靠。
6. 實驗結束后，本公司將結果及時發給客戶，同時根據客戶要求處理相關材料。
7. 客戶應對所提供的材料及信息負責，如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。
服務咨詢及技術支持
- 電話:
- Email: SLBY800@163.COM
技術原理
Real-time PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。
實時熒光定量PCR技術具有te異性強，有效解決了PCR污染問題、自動化程度高等特點，做到PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，準確地確定Ct值，從而根據Ct值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的DNA定量。
技術流程
一、RNA的提取
二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA
三、RNA瓊脂糖凝膠電泳
四、RNA反轉錄為cDNA
Real-Time PCR引物設計的要求
① Tm=55~65 ℃
② GC=30~80%
③ PCR擴增產物長度：引物的產物大小不要太大，一般在80~300 bp之間都可。
④ 引物的退火溫度要高，一般要在60 ℃以上。
五、cDNA與引物質量檢測
選擇te異性好，擴增效率高的引物作為實時熒光使用引物。
六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況：
常用的看家基因有β-actin，GAPDH，18S rRNA
七、定量 PCR檢測
八、擴增曲線和溶解曲線
溶解曲線部為單峰表明為te異性擴增，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期。
