急性髓細胞性白血病（AML）是一類起源于白血病干細胞(LSC)的惡性克隆性疾病，但由于癌癥干細胞的豐度低且與健康的造血干細胞（HSC）具有高度相似性而難以分離，因此阻礙了國際上針對靶向人體惡性細胞同時保留正常細胞的精密治療方法的研究。

單細胞轉錄組克隆追蹤鑒定白血病及白血病前期干細胞

具有高細胞更新率的組織（例如造血系統或腸道）依賴于“專業”成年干細胞來進行持續再生。這些細胞中的致癌突變可導致癌癥，使癌癥保持原始組織的層次結構。只有位于頂層的癌癥干細胞（CSC）才能促進長期的癌癥生長并推動復發，而大部分癌癥由迅速分裂的細胞組成，這些細胞具有自我更新的能力，即在有限的2至4次分裂后耗盡其復制潛能的細胞。由于具有干細胞樣特性，CSC構成了復發的重要驅動力，但其低分裂率使它們難以靶向治療。因此，迫切需要能夠可靠地識別和表征CSC的工具。

基于此，來自美國加利福尼亞州帕洛阿爾托市斯坦?；蚪M技術中心Lars M Steinmetz教授，帶領團隊證明了通過結合單細胞轉錄組學和沿襲追蹤使用核和線粒體體細胞變異體，可以鑒定出LSCs，HSCs和白血病前干細胞并對其進行分子譜分析。雖然突變狀態可以區分健康細胞和癌細胞，但基因表達可以區分干細胞和祖細胞群。相關研究成果以“Identification of leukemic and pre-leukemic stem cells by clonal tracking from single-cell transcriptomics”為題，在線發表在《Nature Communication》雜志上。

為了建立用于單細胞轉錄組數據中人類細胞的克隆追蹤的魯棒實驗裝置，研究人員評估了Smart-seq2協議的各種修改，旨在增加目標多態性基因組位點的覆蓋率。其中發現在逆轉錄過程中包含靶向引物經常會導致形成不希望的副產物，特別是在靶向更多位點時。相比之下，當在cDNA擴增過程中將目標位點作為目標時，該研究團隊獲得了高質量的轉錄組數據，同時與非目標方法相比，每個細胞捕獲的目標位點的平均數目增加了2-4倍。MutaSeq可以穩定地與多達30–40個引物對（靶標）結合使用，當包含更多引物時，文庫質量逐漸降低。在僅使用高度表達的靶基因的測試中，實際上是在所有單個細胞中從所有引物對創建了靶擴增子。

然后，研究人員將單細胞水平的核基因組突變以及線粒體突變稱為單細胞水平，以將細胞聚類為克隆層次?；颊叩拇罅客怙@子組測序已鑒定出以高等位基因頻率出現的已知白血病前突變和以稍低等位基因頻率出現的已知白血病突變（患者1：突變SRSF2，TET2 / CEBPA和SRSF2，TET2 / KLF7 ; 患者2：DNMT3A / NPM1中的突變；患者3：SRSF2 / IDH2突變；患者4：白血病三體性8和BRAF突變）。盡管可以僅根據這些核體細胞突變的調用來得出關于克隆層次的某些陳述，但是這些位點的相對較高的缺失 阻礙了細胞對克隆的穩健分配。此外，結果受到感興趣的突變基因的表達水平的影響：在低表達的細胞中，失靶率更高，導致假陰性檢出率更高，即以突變細胞的錯誤分類作為參考。

為了進一步證明該研究團隊鑒定從頭克隆的能力，研究人員著重介紹了P2中非白血病細胞的克隆擴增。這個克隆將已經通過的辦法單獨依靠基因突變錯過了。有趣的是，這些細胞與白血病前的DNMT3A突變無關。通過再次使用β-二項式模型查詢來自COSMIC數據庫的位點，確定了它們在RPL3基因中具有獨特的突變。這些結果表明，該克隆擴增事件與白血病無關，并且與無關核突變的獲得有關。研究人員還注意到一個單個線粒體變體（5492T> C）標記的P1中假定的非白血病克隆。除了一個例外，所有攜帶這種變異的細胞都對T細胞標記CD3呈陽性反應。因此，盡管不能正式排除它對應于T細胞特異性RNA編輯事件，但該變異可能是在T細胞前體或T細胞克隆中獲得的。

綜上所述，該研究描述了一種聯合單細胞轉錄組學和克隆跟蹤方法（MutaSeq和mitoClone），用于表征LSC，繪制其分化能力并繪制致癌突變的分子結果。雖然單細胞基因表達譜分析可以鑒定具有干細胞特征的細胞，但是使用基因組和線粒體突變進行克隆追蹤可以在健康克隆和癌性克隆之間進行清晰的分離。因此，本研究區分了LSC、HSC、LSC前、健康祖細胞和胚細胞，且已經在急性髓細胞性白血病的背景下證明了這種方法，進一步表明類似的方法可以應用于其他類型的癌癥。

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