1、差速離心

差速離心仍然是最常見(jiàn)的外泌體分離技術(shù)之一。 該方法包括幾個(gè)步驟，包括1）低速離心去除細(xì)胞和凋亡碎片，2）更高速離心以消除更大的囊泡，最后，3）高速離心沉淀外泌體：

不過(guò)需要注意的是，樣本的粘度與分離的外泌體純度有顯著的相關(guān)性，因此，具有高粘度的生物樣品（例如血漿和血清樣本）需要更長(zhǎng)的超速離心步驟和更高的離心速度。

步驟： 以300×g離心10分鐘，取上清。 以2000×g離心10分鐘，取上清。 10，000×g離心30分鐘，取上清。 100，000×g，在4℃下持續(xù)離心90分鐘，去掉上清，留下的沉淀PBS重懸后，再次以100，000×g離心90分鐘。

2、密度梯度離心

該方法將超速離心與蔗糖密度梯度相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)外泌體與非囊泡顆粒分離，例如蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)/RNA聚集體。 因此，該方法將囊泡與不同密度的顆粒分開(kāi)，能夠提取含量低的外泌體。 但是，合適的離心時(shí)間非常重要，否則如果它們具有相似的密度，則仍可在外泌體中發(fā)現(xiàn)污染顆粒。 2018年Li K等人改良了此方案，回收率更高、純度更高，并且結(jié)構(gòu)和功能保持更好（Li K， Wong D， Hong K， Raffai R. Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC)： A Refined and High Performance Method for the Isolation， Characterization， and Use of Exosomes. Methods Mol Biol. 2018；1740：69-83[1]）

3、尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量實(shí)現(xiàn)分離大分子。 該技術(shù)應(yīng)用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根據(jù)其直徑通過(guò)微球，半徑小的分子需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能通過(guò)色譜柱的孔隙遷移，而大分子則從色譜柱中更早地洗脫。 尺寸排阻色譜可以精確分離大小分子。 此外，可以將不同的洗脫溶液應(yīng)用于該方法。 與離心方法相比，色譜分離已被證明具有更多優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)色譜分離的外泌體不受剪切力的影響，這可能會(huì)改變囊泡的結(jié)構(gòu)。 目前，SEC是一種廣泛接受的分離血液和尿液中外泌體的技術(shù)。 不過(guò)，該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合大量樣本處理。

4、過(guò)濾

超濾膜也可用于分離外泌體。根據(jù)外泌體的大小，從蛋白質(zhì)和其他大分子中分離外泌體。 最常見(jiàn)的過(guò)濾膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔徑，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌體，也有設(shè)計(jì)成微柱多孔硅纖毛結(jié)構(gòu)以分離40-100nm外泌體：

不過(guò)，該方法由于過(guò)濾膜的粘附，可能會(huì)損失外泌體，并且過(guò)濾時(shí)的壓力和剪切力，可能會(huì)使外泌體變形受損。

5、基于聚合物的沉淀技術(shù)

基于聚合物的沉淀技術(shù)通常包括將樣本與含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃溫育并低速離心。用于聚合物沉淀的最常見(jiàn)聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用這種聚合物沉淀具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括對(duì)分離的外泌體影響小、pH中性等。目前大多數(shù)快速分離外泌體的商品化試劑盒都是基于此方法。 然而基于聚合物的沉淀方法可能會(huì)同時(shí)分離非囊泡污染物（包括脂蛋白）而且，聚合物材料的混雜可能會(huì)影響下游分析。

6、免疫分離技術(shù)

免疫分離外泌體的原理大多是通過(guò)抗體包被的微球，特異性結(jié)合外泌體。 例如使用抗腫瘤相關(guān)HER2和EpCAM的抗體從腫瘤細(xì)胞中分離出腫瘤來(lái)源的外泌體。 然而，使用抗體包被珠子的分離不適合從大量樣本中獲得外泌體。

還有將抗體包被于ELISA中的那種板上面，直接分離后檢測(cè)、分析、定量。最近的一項(xiàng)研究已應(yīng)用免疫親和超順磁性納米粒子（ISPN）來(lái)結(jié)合外泌體，研究人員通過(guò)連接抗CD63抗體和納米粒子生成ISPN，并用它們從體液中分離外泌體。

7、通過(guò)篩分分離

該技術(shù)利用壓力或電場(chǎng)，通過(guò)膜從樣本中篩出外泌體：

該方法分離時(shí)間短，可以提供較高純度的外泌體。 但是回收率低。(世聯(lián)博研(Bioexcellence)世聯(lián)博研Bioexcellence）

小編推薦會(huì)議  2019（第四屆）外泌體與疾病研討會(huì)

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