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3D單細胞數字圖譜分析系統，3D單細胞數字圖譜研究時空組織結構測量分析系統

三維（3D）幾何模型不僅是定量表征復雜組織的強大工具，而且對探測組織中的結構-功能關系也很有用。然而，由于同時獲取多個（>4）熒光通道的實驗限制，這些模型通常是不完整的。事實上，肝臟的預測幾何和功能模型僅限于少數組織和細胞成分，不包括重要的細胞群體，如肝星狀細胞（HSC）和庫普弗細胞（KCs）。在這里，我們進行了深層組織免疫染色、多光子顯微鏡、深度學習技術和3D圖像處理，以計算擴展同時重建的組織結構的數量。然后，我們生成了肝臟結構的時空單細胞圖譜（），包括小鼠出生后發育不同階段的所有主要組織和細胞成分。我們使用定量研究了1）從出生后早期發育到成年的肝臟形態動力學，以及2）KCs在小鼠肝臟穩態中的結構作用。除了對膽管和正弦網絡重塑的完整描述外，我們的分析還發現了非實質細胞和肝細胞在大小、細胞核數量和DNA含量方面不同的出乎意料的時空模式。令人驚訝的是，我們發現KCs的特異性耗竭改變了HSC的數量和形態。這些發現揭示了肝臟異質性的新特征，并對肝臟組織的結構組織及其功能具有重要意義。該3D單細胞圖譜是了解生理和病理條件下肝組織結構的有力工具。

介紹：

肝臟具有廣泛的功能，包括新陳代謝、解毒、蛋白質合成和產生有助于消化的生化物質。這些不同的功能依賴于復雜的3D組織結構，不同的細胞類型以協調的方式共存和相互作用，因此，對細胞的確切空間位置進行三角測量是理解其作用的關鍵。從宏觀上看，肝臟由稱為小葉的功能解剖單元組成，小葉包括位于中央靜脈（CV）和門三聯體（肝動脈、門靜脈（PV）和膽管）之間的細胞和組織結構。來自腸道、胰腺和脾臟的血液通過PV進入肝臟，并與來自肝動脈的血液混合。然后，血液通過一個稱為血竇的高度分支的血管網絡流向CV，而膽汁則以反平行的方向流經二個膽管（BC）網絡。中央靜脈和門靜脈之間的空間主要由肝細胞和非實質細胞填充。肝細胞是肝功能核心的原代細胞類型，負責處理血液和向BC分泌膽汁。它們被“夾”在正弦內皮細胞之間，并與多個相鄰的肝細胞共享頂端表面，形成3D BC網絡。這種組織允許肝細胞與血竇和BC網絡進行多次接觸，以大限度地交換分子（1）。非實質細胞在肝功能和生長調節中也發揮著重要作用。它們包括肝竇內皮細胞、肝星狀細胞（HSC）和庫普弗細胞（KC）。HSC位于竇和肝細胞之間的Disse間隙，儲存維生素A，并分泌大部分細胞外基質（2）。事實上，HSC的激活是幾種肝病的核心驅動因素（2）。KCs是位于正弦毛細血管內的肝臟特異性自我更新常駐巨噬細胞，在啟動肝臟免疫反應和清除循環內毒素方面發揮重要作用（3）。越來越多的證據表明，肝細胞、HSC和內皮細胞密切接觸，從而形成所謂的“肝生態位。因此，整合在生態位內的任何細胞的功能變化終都可能影響其鄰域，這并不奇怪。

經典組織學在理解肝臟組織結構方面起著至關重要的作用。它簡單、通用，而且容易上手。然而，該技術也存在幾個缺點，1）它不是定量的，2）忽略了3D信息，3）區分非實質細胞差，以及4）一些組織結構不可見，例如BC網絡。組織清除、高分辨率熒光顯微鏡和3D圖像分析的發展使3D肝組織重建能夠以幾何模型的形式進行，以前所未有的細節描述肝組織結構。在過去的幾年里，幾何模型已經被證明是游戲規則的改變者，并闡明了肝組織組織的基本原理。一些主要發現包括：i）肝細胞基于其倍性表現出明顯的空間分帶，ii）膽汁動力學的一個預測模型，iii）肝細胞性表現出液晶順序，iv）肝部分切除術后的肝再生需要生物力學生長控制，和v）非酒精性脂肪肝患者的人類肝臟活檢的3D重建顯示3D BC網絡中存在嚴重的拓撲缺陷，導致分帶性微膽汁淤積。

到目前為止，熒光顯微鏡通常被限制為多四個熒光標記。由于這一限制，3D幾何模型無法同時描述所有主要細胞類型和組織結構，從而忽略了肝生態位的組織。同時重建所有重要的組織網絡（BC和血竇）、細胞（肝細胞、HSC和KCs）和亞細胞成分（細胞核）需要至少六種不同的標記物，因此不可能同時觀察到所有感興趣的結構，該系統結合了深層組織免疫染色、光學清除、多光子顯微鏡、深度學習技術和3D圖像處理，虛擬地擴展了標記物的數量，并生成了肝組織的時空3D單細胞圖譜。我們使用來描述出生后早期發育過程中的形態學變化以及KCs在肝組織結構中的結構作用。該圖譜提供了一個強大的工具來定量描述每種細胞類型、其空間組織及其可能的交叉相互作用。將有助于識別肝臟結構的（亞）結構特征，為了解肝臟生物學和病理學提供前所未有的定量工具。