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細胞模型構建、鑒定、增殖、轉染服務
服務項目簡介
細胞轉染即把核酸導入細胞。常規轉染技術分為兩類：瞬時轉染和穩定轉染。瞬時轉染外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平表達，通常可持續幾天（1-3天）。穩定轉染需要通過一些選擇性標記來進行反復篩選得到穩定轉染的同源細胞系。目前使用廣泛的是脂質體介導法，另有很多商品化的轉染試劑可供選擇。
技術方法、原理及應用
轉染方法 |
原理 |
應用 |
特點 |
磷酸鈣法 |
磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞 |
穩定轉染、瞬時轉染 |
不適用于原代細胞，轉染效率高，對細胞毒性小，但技術要求很高 |
電穿孔法 |
高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入 |
穩定轉染，瞬時轉染 |
簡單，可重復性高 對細胞有毒副作用 轉染時需除血清 |
陽離子脂質體法 |
帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞 |
穩定轉染，瞬時轉染 |
適用性廣，轉染效率高，重復性好，轉染時需除血清。轉染效果隨細胞類型變化大 |
病毒介導法 |
通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 |
穩定轉染 |
用于難轉染的細胞，原代細胞，體內細胞等 |
技術步驟（脂質體法）
（1）脂質體介導的質粒DNA轉染法
① 轉染前一天接種細胞，細胞密度在40-60%，每孔加培養基2 ml （六孔板，無抗生素）。
② 細胞接種23小時后用1.5 ml Opti-MEM更換舊的培養液以提高轉染效率。
③ 換液1小時后開始轉染質粒，按如下步驟準備質粒-轉染試劑混和液：
250 μlyou化培養基稀釋10 μl的轉染試劑Lipofectamine 2000，輕輕混和且在室溫孵育5min；
250 μlyou化培養基稀釋4 μg質粒，輕輕混和并在室溫孵育5min；
將稀釋的質粒和稀釋的轉染試劑輕輕混和，室溫培養30min以形成質粒-轉染試劑混和物。
④ 將質粒-轉染試劑混和液加入每個含有細胞及培養液的孔中，輕輕搖晃孔板混和。
⑤ 培養6-7小時換液，換成細胞正常生長所需培養基。
⑥ 在CO2培養箱中培養24-48小時，Real-time-PCR或Western blot檢測表達效果。
（2）脂質體介導的siRNA轉染法
① 轉染前一天接種細胞，細胞密度在30-50%，每孔加培養基2 ml （六孔板，無抗生素）。
② 細胞接種后23小時后用1.5 ml Opti-MEM更換舊的培養液以提高轉染效率。
③ 換液1小時后開始轉染siRNA，按如下步驟準備siRNA-轉染試劑混和液：
250 μlyou化培養基稀釋10μl的轉染試劑LipofectAMINE 2000，輕輕混和且在室溫孵育5min；
250 μlyou化培養基稀釋50 nM siRNA，輕輕混和并在室溫孵育5min；
將稀釋的siRNA和稀釋的轉染試劑輕輕混和，室溫培養30min以形成siRNA-轉染試劑混和物。
④ 將siRNA-轉染試劑混和液加入每個含有細胞及培養液的孔中。輕輕搖晃孔板混和。
⑤ 培養6-7小時換液，換成細胞正常生長所需培養基。
⑥ 在CO2培養箱中培養24-48小時，Real-time PCR或Western blot檢測干擾效果。
（3）穩定的脂質體轉染
① 轉染方法同前
② 在轉染后24小時，消化細胞，并將細胞接種于96孔板，每孔1-2個細胞以便進行單克隆篩選。24小時后，加入適量抗生素（根據質粒所帶的篩選標記）篩選，得到穩定表達的細胞。
應用領域
- 瞬時/穩定高表達細胞的構建、鑒定和增殖
- 瞬時/穩定干擾表達細胞的構建、鑒定和增殖
- 帶有報告基因或標簽的瞬時/穩定高表達細胞的構建、鑒定和增殖
- 帶有報告基因或標簽的瞬時/穩定干擾表達細胞的構建、鑒定和增殖
實用實例
高表達載體 脂質體轉染293細胞24小時
服務周期
我公司在正式接受實驗委托1~2個月左右交付構建好的細胞株。
服務咨詢及技術支持
電話:
Email: slby800@163.com
